磷脂酰絲氨酸（Phosphatidylserine, PS）是一種具有調節(jié)大腦功能、改善認知等生理活性的磷脂類物質，傳統(tǒng)提取法（從動物腦組織、大豆中提?。┐嬖谠鲜芟蕖⒓兌鹊?、成本高等問題。微生物發(fā)酵法以酵母為宿主菌合成磷脂酰絲氨酸，具有原料廉價、可規(guī)?；?、產物純度高的優(yōu)勢，其核心在于高產菌株的篩選與代謝通路的定向改造。以下從菌株篩選原則、酵母代謝通路基礎、改造策略及關鍵技術展開分析。

一、高產磷脂酰絲氨酸酵母菌株的篩選原則與初始菌株選擇

1. 篩選核心原則

酵母菌株需滿足自身磷脂合成能力強、遺傳操作可控、發(fā)酵耐受性好三大核心條件，具體篩選指標包括：

基礎磷脂酰絲氨酸產量：野生型酵母（如釀酒酵母）自身可合成磷脂酰絲氨酸，篩選天然的產量＞5mg/L的菌株作為出發(fā)菌株；

生長特性：在廉價培養(yǎng)基（如葡萄糖、玉米漿培養(yǎng)基）中生長速率快，耐受高滲透壓、高溶氧環(huán)境，適合高密度發(fā)酵；

遺傳穩(wěn)定性：易于進行質粒轉化或基因組編輯，且改造后菌株的遺傳性狀穩(wěn)定，不易發(fā)生回復突變；

副產物少：發(fā)酵過程中不產生大量有機酸、乙醇等抑制性副產物，避免對磷脂合成的反饋抑制。

2. 常用初始菌株

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：食品安全級菌株（GRAS），磷脂合成通路研究最透徹，遺傳操作工具成熟，是生產食品級、醫(yī)藥級磷脂酰絲氨酸的首選宿主；

解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）：油脂和磷脂合成能力強，可利用多種碳源（如油脂、甘油），適合工業(yè)化高密度發(fā)酵；

畢赤酵母（Pichia pastoris）：表達外源基因效率高，可分泌表達磷脂合成相關酶，減少胞內產物降解風險。

二、酵母合成磷脂酰絲氨酸的天然代謝通路基礎

酵母胞內磷脂酰絲氨酸的合成主要依賴磷脂酰膽堿（PC）-磷脂酰乙醇胺（PE）-PS轉化通路和CDP-二酰甘油（CDP-DAG）直接合成通路，兩條通路協(xié)同調控磷脂酰絲氨酸的積累：

CDP-DAG 直接合成通路（核心通路）該通路是酵母合成磷脂酰絲氨酸的主要途徑，反應步驟如下：

糖酵解產物磷酸二羥丙酮生成磷脂酸（PA），PA 在磷脂酸磷酸酶作用下生成二酰甘油（DAG）；

DAG與CTP在CDP-DAG合成酶（Cds1p） 催化下生成CDP-DAG；

CDP-DAG與絲氨酸在磷脂酰絲氨酸合成酶（Pss1p） 催化下生成磷脂酰絲氨酸，該酶是此通路的限速酶，直接決定 PS 的合成速率。

PE-PS轉化通路（輔助通路）磷脂酰乙醇胺（PE）在磷脂酰絲氨酸脫羧酶（Psd1p/Psd2p） 作用下可反向生成磷脂酰絲氨酸（酵母中該反應可逆），但反應效率較低，需通過改造增強該通路的通量。

關鍵調控節(jié)點

限速酶Pss1p：受胞內磷脂酰絲氨酸濃度的反饋抑制，且其編碼基因PSS1的表達量較低，是通路改造的核心靶點；

輔因子供應：絲氨酸是合成磷脂酰絲氨酸的底物，胞內絲氨酸濃度不足會限制它的合成；CTP是CDP-DAG合成的能量底物，需保障其充足供應；

磷脂轉運：合成的磷脂酰絲氨酸主要積累在細胞膜上，需通過磷脂轉運蛋白（如Mss4p）將它轉運至胞內儲存，減少分泌流失。

三、高產酵母菌株的代謝通路改造策略

針對天然通路的限速步驟、底物供應、反饋抑制等瓶頸，采用基因工程編輯技術（如CRISPR-Cas9、同源重組）進行定向改造，核心策略包括以下4個方面：

1. 強化核心合成通路，解除限速酶抑制

過表達限速酶編碼基因將強啟動子（如釀酒酵母的TEF1啟動子、GPD啟動子）與PSS1基因融合，整合至酵母基因組，提升磷脂酰絲氨酸合成酶的表達量，直接提高磷脂酰絲氨酸合成速率。研究表明，過表達PSS1基因可使釀酒酵母的磷脂酰絲氨酸產量提升2~3倍。同時，過表達CDS1基因（編碼CDP-DAG合成酶），增加前體物CDP-DAG的供應，緩解底物限制。

解除限速酶的反饋抑制通過定點突變改造Pss1p的活性中心，降低其對產物磷脂酰絲氨酸的親和力，消除反饋抑制，例如，突變Pss1p的第156位丙氨酸為甘氨酸，可使酶活性提升40%，且不再受其濃度的抑制。

2. 優(yōu)化底物供應通路，保障前體與輔因子充足

強化絲氨酸合成通路絲氨酸是磷脂酰絲氨酸的直接底物，酵母中絲氨酸由3-磷酸甘油酸經3-磷酸甘油酸脫氫酶（Ser3p） 催化合成。過表達SER3基因，同時敲除絲氨酸降解基因 SHM1（編碼絲氨酸羥甲基轉移酶），可使胞內絲氨酸濃度提升50%以上，顯著促進磷脂酰絲氨酸合成。此外，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加廉價的L-絲氨酸（或其前體物甘氨酸），可進一步提升胞內底物濃度。

保障CTP輔因子供應CTP由UTP在CTP合成酶（Ura7p） 催化下生成，過表達URA7基因可增加CTP的合成量，為CDP-DAG的生成提供能量，避免因能量不足導致的通路停滯。

3. 阻斷競爭通路，減少碳流流失

酵母胞內的磷脂合成存在多條競爭通路（如合成PC、PE、磷脂酰肌醇等），這些通路會消耗共同前體物CDP-DAG，降低磷脂酰絲氨酸的碳流分配比例。

敲除競爭通路關鍵基因：敲除CHO1基因（編碼磷脂酰乙醇胺甲基轉移酶，催化PE合成PC），阻斷PC合成通路，使碳流更多流向磷脂酰絲氨酸合成；

弱化磷脂降解通路：敲除PLC1基因（編碼磷脂酶C，降解磷脂生成DAG），減少磷脂酰絲氨酸的降解，提升產物積累量。

4. 增強產物轉運與儲存，減少胞外分泌

合成的磷脂酰絲氨酸易結合在細胞膜上，過量積累會影響細胞膜的通透性和細胞生長，需通過改造磷脂轉運通路實現(xiàn)它的胞內儲存：

過表達磷脂轉運蛋白基因：過表達MSS4基因（編碼磷脂酰肌醇激酶，參與磷脂轉運），促進細胞膜上的磷脂酰絲氨酸轉運至胞內脂滴中儲存；

構建工程化脂滴：過表達脂滴形成相關基因（如ARE1、DGA1），增加胞內脂滴數(shù)量和體積，為磷脂酰絲氨酸提供儲存位點，避免產物對細胞的毒性。

四、菌株改造的關鍵技術與篩選驗證

1. 高效基因編輯技術

CRISPR-Cas9技術：精準敲除或插入目標基因，具有操作簡便、效率高的優(yōu)勢，適合多基因的協(xié)同改造；

同源重組技術：將外源基因（如強啟動子驅動的PSS1）整合至酵母基因組的特定位點（如非必需基因位點），保障基因表達的穩(wěn)定性；

質粒表達系統(tǒng)：構建多拷貝表達質粒，實現(xiàn)多個通路基因的同時過表達，適合快速篩選最優(yōu)基因組合。

2. 高通量篩選與驗證方法

初篩：采用薄層層析（TLC） 快速檢測發(fā)酵液中的磷脂酰絲氨酸含量，篩選出其產量顯著提升的突變菌株；

復篩：通過高效液相色譜（HPLC） 精準定量磷脂酰絲氨酸的產量，同時檢測菌株的生長速率、底物利用率等指標，篩選綜合性能最優(yōu)的菌株；

穩(wěn)定性驗證：將目標菌株連續(xù)傳代10代以上，檢測每代的磷脂酰絲氨酸產量，篩選遺傳性狀穩(wěn)定的菌株。

五、 發(fā)酵工藝優(yōu)化與工業(yè)化應用潛力

代謝通路改造后的高產菌株需結合發(fā)酵工藝優(yōu)化，進一步提升磷脂酰絲氨酸的產量：

培養(yǎng)基優(yōu)化：優(yōu)化碳源（葡萄糖/甘油比例）、氮源（酵母膏/尿素）、無機鹽濃度，添加 L-絲氨酸、維生素B族等促進因子；

發(fā)酵參數(shù)調控：控制發(fā)酵溫度（28~30℃）、pH（5.5~6.0）、溶氧（DO＞30%），采用分批補料發(fā)酵策略，避免葡萄糖過量導致的乙醇積累；

誘導表達調控：使用誘導型啟動子（如半乳糖誘導的GAL1啟動子）控制關鍵基因的表達，在菌株生長至對數(shù)期后誘導表達，減少基因過表達對細胞生長的負擔。

目前，經代謝通路改造的釀酒酵母菌株，在實驗室分批補料發(fā)酵條件下，磷脂酰絲氨酸產量可達500~800mg/L，部分工程菌株產量突破1g/L，具備工業(yè)化放大潛力。

微生物發(fā)酵法生產磷脂酰絲氨酸的核心是通過菌株篩選+代謝通路改造，實現(xiàn)酵母胞內磷脂酰絲氨酸合成的“開源、節(jié)流、穩(wěn)儲”。未來的研究方向將聚焦于：

挖掘新的高產酵母菌株（如極端環(huán)境酵母），拓展宿主菌的選擇范圍；

結合合成生物學技術，構建人工合成的磷脂酰絲氨酸合成通路，進一步提升碳流分配效率；

開發(fā)高效的產物分離提取工藝，降低下游純化成本，推動發(fā)酵法磷脂酰絲氨酸的產業(yè)化應用。